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双靶点CRISPR载体构建 (哺乳动物细胞)q1822235623
点击次数:1678 发布时间:2019/7/1 11:29:01
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双靶点CRISPR载体构建 (哺乳动物细胞)
上海海吉浩格生物科技有限公司
1. CRISPR/Cas9核酸酶切靶序列原理图
2 相关载体图谱
2.1中间载体 ,sgRNA载体(预设有BbsI酶切位点)
中间载体
2.2 CRISPR/Cas9骨架载体,表达CAS9,同时有完整的sgRNA表达框
含有CAS9的骨架载体
(骨架载体可以换成PX459、PX461,PX462、lenticrispr V2、lentiguide-puro或者其他同种gRNA scaffold的质粒)
3. 基因组靶位点选择和双链接头设计
3.1 靶位点选择
根据目的基因的物种在sgRNA设计网站上是设计靶点序列,根据需要选择特异性好的两个sgRNA靶点序列。
注(20nt靶点中F和R是为了标记序列方向的碱基,F--R为正向,R--F为反向互补;N和M都代表任意碱基,本文N20代表sgRNA1,M20代表sgRNA2)
对个目的基因设计2个靶点。建议在ORF 5’区和功能结构域各设计1个靶点,使之任何1个靶点的突变都可以产生功能缺失,或2个靶点之间的序列被敲除。
3.2引物设计
PCR产物核心公共序列
gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttgttttCTAGCAAAATAGGCTGTCCCCGCGGGGCATGACTATCGTCgagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccG
PCR扩增后的序列
GaagacaccaccG-FNNNNNNNNNNNNNNNNNNR-gttttagagctagaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtcggtgcttttttgttttCTAGCAAAATAGGCTGTCCCCGCGGGGCATGACTATCGTCgagggcctatttcccatgattccttcatatttgcatatacgatacaaggctgttagagagataattggaattaatttgactgtaaacacaaagatattagtacaaaatacgtgacgtagaaagtaataatttcttgggtagtttgcagttttaaaattatgttttaaaatggactatcatatgcttaccgtaacttgaaagtatttcgatttcttggctttatatatcttgtggaaaggacgaaacaccG-FMMMMMMMMMMMMMMMMMMR-gtttaggtcttc
引物共用序列
F: GTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAA
R: CGGTGTTTCGTCCTTTCCAC
设计完成的序列
sgRNA1-F(PX458):
5-gaagacaccaccGFNNNNNNNNNNNNNNNNNNRGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3
sgRNA2-R:
5- gaagacctaaacRMMMMMMMMMMMMMMMMMMFCGGTGTTTCGTCCTTTCCAC -3
注1:这对引物是以PX458/PX459为骨架载体,选择BbsI酶切位点(lentiguide和lenticrispr v2建议设计为BsmBI),同时正向引物需要加长;
注2:这种方法设计引物比较长,引物合成和后续PCR会有困难,也可以每条sgRNA设计两个短的引物进行巢式PCR。
3.3 PCR扩增序列
根据设计的两个靶点的引物,扩增插入序列
以pCMV-sgRNA-hU6-Twinstrep为模板扩增得到如下目的序列
4 中间gRNA表达盒与表达CAS9骨架载体的连接
本载体系统可采用2种策略进行Cas9载体和多个gRNA表达盒片段的次连接组装:
策略I:用Golden Gate cloning (ligation)方法 (Engler et al., 2008; 2009);
策略II:是传统的酶切回收保存,酶切后的载体可以多次使用,片段单独酶切回收的方法。注:策略II载体单独回收保存,设计中间gRNA表达盒扩增引物时,可以自由选择实验室比较适宜的IIS限制性内切酶,不定需要和载体同样的酶。
5 测序检测
构建成功之后的双sgRNA表达框如下
两个表达框中间设计有测序引物RVP3可以测序sgRNA2表达框,测序引物RVP4可以测序sgRNA1表达框。因两个表达框序列相识度比较高、结构复杂,可能会导致测序结果不好。如果骨架载体常用建议在骨架载体上重新选择引物测序,选距离两侧大于200bp远的位置设计测序引物。
附件
中间载体pCMV-sgRNA-hU6-Twinstrep介绍
1,pCMV-sgRNA-hU6-Twinstrep中插入的sgRNA表达框不是正常的结构,而是倒置的结构,不能单独使用,需要配合原有的sgRNA表达框(插入hU6- -gRNA scaffold之间)使用,才能形成(hU6- gRNA scaffold-hU6- gRNA scaffold)双表达框结构。
插入序列结构 BbsI-gRNA scaffold-测序引物-hU6启动子-BbsI
红色G是根据addgene部分构建好的质粒经验,在sgRNA的20个碱基之,建议保留sgRNA插入红色G和gRNA scaffold之间。
插入序列中引入引物RVP3和RVP4作为测序引物,是荧光素酶报告基因质粒的常用引物,为防止和Cas9骨架质粒引物重复导致无法测序。为了压缩质粒大小(省钱),两个表达框之间没有插入太多碱基,尽管插入两个比较常用引物序列,结构复杂也有可能导致测序套峰或者中断的可能。如果测序不好建议在骨架质粒上设计引物测序
载体中sgRNA表达框两侧都加了BbsI酶切位点,在以pX458/pX459等酶切位点为BbsI为酶切位点的Cas9骨架载体时候,引物可以相对小些。
5-gaagacaccaccGFNNNNNNNNNNNNNNNNNNRGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAG-3
2,为了不浪费的原则,我们构建载体的时候将这个sgRNA-U6的表达框插入到个哺乳动物过表达载体中,切掉sgRNA-U6表达框就是个完整的带有Twin-Strep-tag (Schmidt et al., 2013)的超小过表达空载体。sgRNA表达框两侧设计有两个XhoI酶切位点,用XhoI酶切之后回收自连即可。
双靶点CRISPR载体构建 (哺乳动物细胞)
双靶点CRISPR载体构建 (哺乳动物细胞)
双靶点CRISPR载体构建 (哺乳动物细胞)
更新时间:2023/11/11 13:10:49
标签:基因编辑 质粒 CRISPR cas9 质粒宝
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